目的蛋白的多种表达形式与影响

目的蛋白可能以不同形式存在，最普遍的情况包括翻译后修饰。例如，糖基化是常见的修饰方式，常涉及的氨基酸包括丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)和羟赖氨酸(Hydroxylysine)。以CD2为例，查询Uniprot可知，其理论分子量约为39 kDa，但表观分子量通常在45 kDa左右，原因在于CD2的多个位点进行了糖基化修饰。在实验中，若想探讨分子量差异是否由糖基化引起，可以使用糖苷酶PNGaseF去除糖基后进行Western Blot (WB)分析。此外，还存在磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化等多种翻译后修饰，因此深入了解这些修饰对蛋白质特性的影响至关重要。

蛋白的剪切和其影响

以Caspase-7为例，其存在多种形式：Procaspase-7（前体，约37 kDa）、Intermediate caspase-7（中间形式，约28 kDa）和Caspase-7 p20（活化片段，约20 kDa）。Procaspase-7为未激活前体，具有较大的分子量。当细胞接受凋亡信号，procaspase会被自身切割或其他caspase切割激活，形成较小的活性亚单位。可以通过设定诱导组与非诱导组来验证剪切后的分子量变化，并发现在电泳中，剪切后的表观分子量通常会减小。

蛋白电泳中多聚体与共价结合聚体的识别

如果表观分子量相较于预测分子量显著增加，需要考虑是否形成了多聚体。可以通过添加还原剂如DTT来验证是否为非共价结合聚体。

针对小分子量蛋白的电泳挑战

对于小于20 kDa的蛋白，传统的Tris-Glycine系统在SDS-PAGE中的分离效果不足。主要原因包括离子前峰的影响、低分子量蛋白质的迁移问题及缓冲系统pH值的影响。建议使用Tricine-SDS-PAGE体系对小分子量蛋白进行分离，因为Tricine的pKa值较低，能够减少游离DS-离子的影响，提供更高的分辨率。

蛋白Marker的选择与问题

预染marker虽然使用方便，但因其偶联了染料可能导致分子量偏移，并且同一marker在不同电泳体系中的迁移速度可能不同，需谨慎选择。

样本制备的关键因素

膜蛋白在95度加热变性时可能出现聚集，从而导致条带表观分子量增大。此外，样本变性或还原不彻底会影响抗原表位的暴露，进而影响迁移速率。注意保证上样缓冲液足量并在保质期内，选择合适的裂解液。同时，确保样本的新鲜度，以免发生降解。

准确评估样本的表达情况

在解决以上问题时，最重要的是充分了解自己的样本是否表达目的蛋白及其表达丰度，并查询厂家的验证图以了解抗体的特异性。通过这些步骤，WB实验的可靠性将显著提升，为研发与实验提供更可信的支持。

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